Metode de identificare a fosforilării și glicozilării proteinelor

Principalele metode de identificare a fosforilării sunt următoarele: a. Analiza fosforilării in vitro: Reacțiile kinazei radiometrice care utilizează 32P-gamma-ATP pot fi utilizate pentru a detecta starea de fosforilare in vitro; această metodă este semi-cantitativă, dar poate determina greutatea moleculară a proteinelor fosforilate. b. Etichetarea pulsului radioactiv: Pentru a detecta fosforilarea in vivo, se poate folosi marcarea pulsului radioactiv; celulele sunt crescute în prezența ortofosfatului 32P și apoi o anumită proteină este imunoprecipitată cu un anticorp specific. Radioizotopul obținut prin precipitare este analizat prin electroforeză SDS-PAGE și cuantificat prin expunerea filmului cu raze X. Această metodă poate detecta fosforilarea în diferite condiții fiziologice. c. Anticorpi specifici de fosforilare: Există două categorii de anticorpi specifici de fosforilare. Prima categorie este un anticorp universal de fosforilare tirozină/serină/treonină care se va lega de orice tirozină fosforilată, serină fosforilată și moleculă de treonină fosforilată, indiferent de resturile de aminoacizi adiacente; a doua categorie de anticorpi este un anticorp de epitop aminoacid specific fosforilării. Desigur, metodele de mai sus pot fi combinate cu modul de achiziție a datelor sau după spectrometria de masă pentru a identifica situsurile de fosforilare (putative), utilizați anticorpi universali pentru situsurile de fosforilare pentru a determina dacă proteina țintă este fosforilată la un anumit tip de situs prin imunoprecipitare (IP) .

Analiza glicozilării poate fi efectuată prin digestia enzimatică (cum ar fi digestia cu tripsină) a proteinei de analizat, urmată de analiza glicopeptidelor folosind cromatografie lichidă-spectrometrie de masă (LC-MS) sau cromatografie de interacțiune hidrofilă-spectrometrie de masă în tandem (HILIC-MS/). MS) pentru a identifica toate proteinele cu molecule specifice de glican sau situsurile de legare a glicanului din proteina țintă. În plus, pentru unele glicopeptide, analiza prin spectrometrie de masă (MS) a proteinelor intacte poate furniza date despre identificarea speciilor de proteine ​​și starea lor de glicozilare, dar la o rezoluție mai mică.

În rezumat, deși metodele de identificare a fosforilării și glicozilării proteinelor sunt diferite, ambele pot fi analizate utilizând spectrometrie de masă, inclusiv identificarea proteinelor fosforilate/glicozilate, a situsurilor de modificare de fosforilare/glicozilare și a nivelurilor de modificare. Spectrometria de masă a devenit, de asemenea, una dintre cele mai populare tehnologii de cercetare a modificării post-translaționale datorită rezoluției, acurateței și sensibilității sale superioare.